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第27部分

考博生化和分子生物学复习笔记-第27部分

小说: 考博生化和分子生物学复习笔记 字数: 每页4000字

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常用的化学试剂和酶,比如本题中K…2 要知道这是在氨基酸组成分析中表示有2个赖氨酸残基,再如要知道 DNFB是用在哪一步 上,作用是什么,才能得出相应的结论。 
答案:1。从题目所给氨基酸组成分析的结果:K…2 表示有 2 个赖氨酸残基,R…1 表示有 1 个精氨酸残基,其他同理,我们可知道多肽链中氨基酸残基的种类和数目,该肽链共有 38 个氨基酸组成。 2。DNFB 即二硝基氟苯,用于氮末端氨基酸分析,题中样品与 DNFB 反应,再经酸水解得 到DNP…Asn,说明此肽链N末端氨基酸为Asn(天冬酰胺)。 3。对于氨基酸序列分析,常需先将整条肽链切成小的肽段,常用的胰蛋白酶法水解赖氨酸(K) 或精氨酸(R)的羧基形成的肽键,溴化氰法水解甲硫氨酸(M)羧基侧的肽键,胰凝乳蛋白酶 水解芳香族氨基酸(F、W、Y)羧基侧的肽键,所以此题中如果这些氨基酸残基都不在碳末 端的话,下一步如果用胰蛋白酶将切在1个R和2个K羧基侧肽键,形成4个肽段,同理 若用溴化氰,因为M有2个,将得到3个片段,用胰凝乳蛋白酶酶切,因为F有1个,W 有2个,Y为0个,也将得到4个片段。(1996年北医)
 二、说明酶的结构与功能的关系 考点:酶的分子结构与功能 解析:1。酶的分子组成:分单纯酶和结合酶,其中结合酶的酶蛋白部分决定反应的特异性, 辅助因子部分决定反应的种类与性质。 2。酶分子的结构与功能:酶分子中与酶的活性密切相关的基团称必需基团。一些必需基团在 空间结构上彼此靠近,组成具有特定空间结构的区域,能与底物特异结合并将其转化为产物, 这一区域即为酶的活性中心,酶分子中各种结构基团与其功能关系如下: 
三、如何从血液中分离纯化清蛋白(MW:68500,PI=4。9)?请举出两种分离纯化的方法, 简要说明各种方法的基本原理及基本流程。(1998年,北医) 考点:蛋白质的分离与纯化 解析:分离纯化蛋白质的方法有多种,应利用蛋白质物理、化学性质的差异,选择合适的方 法,将其分离纯化。如本题中可利用清蛋白分子量与其他蛋白不同的性质,采用凝胶过滤层 析的方法,也可利用蛋白质沉淀的性质,采用盐析的方法,或利用其两性游离及等电点、分 子大小等与其他蛋白的差异采用电泳的方法等。 答案:1。凝胶过滤层析:层析柱内填充带有网孔的凝胶颗粒,根据清蛋白分子量,选用合适 大小网孔的凝胶,将血液加于柱顶端,以其所含的清蛋白球蛋白为例,清蛋白分子小进入凝 胶孔内,球蛋白分子量大于网孔的分离上限,不进入孔内而直接流出,清蛋白因在孔内被滞 留随后流出,从而清蛋白与球蛋白得以分离,而血液中含有的其他杂蛋白同理因其与清蛋白 的分子大小的差异,可以与清蛋白分离,最终得到纯化的清蛋白。 2。盐析:硫酸铵等中性盐因能破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素,故能使蛋白质发生
   

沉淀,不同蛋白质分子颗粒大小不同,亲水程度不同,盐析所需要的盐浓度也不同,从而将 蛋白质得以分离。如用硫酸铵分离纯化清蛋白,在半饱和的硫酸铵溶液中,球蛋白即可从血 清中沉淀析出而除掉,再加硫酸铵溶液至饱和,则清蛋白沉淀析出,从而清蛋白可以分离出 来,再用透析,除去清蛋白中所含的硫酸铵,清蛋白即可被纯化。 
四、酶的活性中心以外的结构有何作用(1998北医) 考点:酶的分子结构与功能 解析:酶的活性中心的作用是与底物结合并催化底物转化为产物,而其他活性中心以外的结 构也是不可缺的,其主要作用如下: 1。活性中心外的一些基团为维持酶活性中心应有的空间构象所必需,是维系活性中心三维结 构的骨架。 2。还可与作用物广泛性的结合,所释放的能量,可在热力学上推动反应的进行。 3。可决定酶促反应的特异性。 4。一些活性中心外的结构具有调节区,体内一些代谢物可与此调节部位特异结合,引起酶蛋 白分子构象变化,从而影响酶与底物的结合,改变酶活性,这即为酶的变构调节。 
五、牛胰核糖核酸酶能否水解 pGpGpApGpApA 序列,若能在何处水解,产物为何物?若 不能说明原因(1993北医) 考点:核糖核酸酶的分类及作用机理 解析:水解核酸的酶称核酸酶,分 RNA酶和DNA 酶,也可从作用部位分内切核酸酶和外 切核酸酶,一般性的内切核酸酶特异性较低,识别作用于某一种或多种核苷酸残基,牛胰核 糖核酸酶,作用于RNA链中嘧啶核苷酸残基C…3′磷酸基与下一核苷酸残基C…5′的磷酸二 酯键,将RNA链断裂。题中所给序列不含嘧啶核苷酸,故牛胰核糖核酸酶不能水解。 
六、A:有份核酸样品,可能混有少许蛋白质,只允许定性测定一种元素即可确定其有无蛋 白质污染,你选测哪一种元素,为什么? B 有多种方法可区分高分子量 DNA 与 RNA 分子,请写出一种最简便可行的分析方法,简 要说明理由(1994北医) 考点:核酸的组成及性质 解析:A:要确定有无蛋白质污染,只须测定样品中是否含有只存在于蛋白质而不存在于核 酸的元素,如果样品中有此元素存在,很明显说明存在蛋白质污染,满足此条件的是硫,核 酸一般不合S,而大多数蛋白质含有S。 B:DNA 与 RNA 一大区别在于 DNA 为双链结构,而 RNA 为单链结构,只在局部形成双 链。故DNA在加热时,双链可解开,其260nm吸光度值会升高,而RNA即使加热变性, 其260nm吸光值也变化不大,故可通过加热前后DNA与RNA在260nm处吸光值的变 化来区分DNA和RNA。 
七、某生物化学家发现并纯化了一种新的酶,纯化过程及结果如下表: 操作程序总蛋白(mg)活性(U) 1。粗提取 200004000000 2。盐析沉淀50003000000 3。pH沉淀40001000000 4。离子交换层析 200800000 5。亲和层析50750000 6。排阻层析45675000 根据表中结果: a)计算每一步纯化程序后酶的比活性。 b)指出哪一步对酶的纯化最有效。
c)指出哪一步对酶的纯化最无效。 d)表中结果能否说明该酶已被纯化?若估计酶的纯化程度还需要做些什么? e)若该单纯酶由 682个氨基酸残基组成,该酶的分子量约为多少?(1997,北医) 考点:酶活力测定及酶的分离纯化。 解析:a)酶含量须用酶活力来表示,即在 1分钟内转化1 微摩尔的底物所需的酶量为一个 单位,而每毫克酶蛋白所具有的酶活力,称比活力,用单位/毫克蛋白表示。 故每一步纯化程序后酶的比活性为1。4000000〖〗20000=200(U/mg) 2。3000000〖〗5000=600(U/mg) 3。1000000〖〗4000=250(U/mg) 4。800000〖〗200=4000(U/mg) 5。750000〖〗50=15000(U/mg) 6。675000〖〗45=15000(U/mg) b)对同一种酶来说,比活力愈高,表明酶愈纯,从第 4 步到第 5 步酶的比活力明显提高, 故亲和层析一步对酶的纯化最有效。 c)从第 5步到第 6步,酶的比活力无变化,所以第 6步对酶的纯化最无效。 d)因为第 5 步和第 6 步的比活力一样,也就是说经过排阻层析后酶的纯度无变化,所以该 酶基本上已被纯化。 e)一般每个氨基酸残基含一个氮原子,原子量为 14,而每种蛋白质分子的含氮量都约为 16%故,设蛋白质分子量为 x,则14×682〖〗x=16%,x=59675。 
八、已知某多肽组成是 Ala5、Lys1,Phe1 与 2,4…二硝基氟苯(DNFB)反应后再酸解产 生一个游离的DNFB…Ala,胰蛋白酶解得一个三肽:Lys1;Ala2和一个四肽Ala3、Phe1, 整个多肽经糜蛋白酶解产生一个六肽和一个游离氨基酸,写出这个多肽的一级结构(1992 北医) 考点:氨基酸序列分析 解析:1。多肽与DNFB反应再酸解产生一个游离的DNFB…Ala,说明此肽的N末端氨基酸 残基是Ala。 2。胰蛋白酸水解 Lys、Arg 羧基侧的肽键,题中多肽无Arg。且被此酸水解成一个三肽和一 个四肽,说明第3位氨基酸残基是Lys。 3。糜蛋白酶水解 Phe、Tyr、Trp 羧基侧的肽键,此多肽中只存在Phe,且被此酶水解成一 个六肽和一个游离氨基酸,说明其第6位氨基酸残基是Phe。 4。此多肽一共有 7 个氨基酸残基组成5 个Ala,1 个Lys,1 个 Phe,所以剩余的2、4、5、 7 位全是 Ala。故此多肽一级结构为(从N 端到 C端):Ala…Ala…Lys…Ala…Ala…Phe…Ala 九、磷酸酶、磷酸化酶、激酶、蛋白激酶有何区别?各举一例(1994北医) 考点:对酶定义的理解 解析:磷酸酶是将酶或蛋白质上磷酸基水解下来的酶,如磷蛋白磷酸酶可将磷酸化的糖原合 酶上的磷酸基水解掉使其恢复活性。 磷酸化酶是将某一物质水解并将其磷酸化的酶,如糖原磷酸化酶是在糖原分解过程中从糖链 上水解掉葡萄糖生成1…磷酸葡萄糖的酶。 激酶包括多种,能将 ATP 磷酸基转移给接受体的反应都由激酶催化,如己糖激酶即可催化 葡萄糖生成6…磷酸葡萄糖。 蛋白激酶也是激酶的一种,它多是在酶活性调节中发挥作用,将酶的丝氨酸、苏氨酸等残基 磷酸化,发挥共价修饰作用,使其活性升高或降低,如蛋白激酶 A 可将糖原合成酶磷酸化 使其失去活性。 十、从以下几方面对蛋白质及DNA进行比较(1999北医)
   
(1)分子组成(2)一、二级结构(3)主要生理功能 十一、叙述tRNA一、二级结构要点及其与当前已知的分子结构与功能的关系(1999北医) 考点:tRNA的分子结构与功能 解析:tRNA一级结构:由核糖核苷酸通过磷酸二酯键连成的单链分子 二级结构:核苷酸链中存在着一些局部互补配对的区域,可以形成局部双链,进而形成一种 发夹结构,局部配对的双链构成茎状,中间不配对的部分膨出成环状,故其二级结构成三叶 草形,左右两侧稀有碱基环称二氢尿嘧啶环和假尿嘧啶环,位于下方的称反密码环,此环中 间3个碱基即为反密码子,3′端为CCA…OH末端。 与分子功能的关系:tRNA功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体并将其转 呈给 mRNA,具体来说靠其 3′末端 CCA…OH 与氨基酸结合成氨基酰…tRNA,反密码子与 mRNA上的密码子形成碱基互补,蛋白质生物合成时靠反密码子辨认 mRNA上密码子,然 后携带密码子编码的氨基酸至核蛋白体,参与蛋白质合成。 十二、(1)何谓酶蛋白、辅酶、活性部位?它们在酶催化反应中起何作用? (2)何谓竞争性抑制?就酶反应动力学有关参数指出它与非竞争性抑制的区别(1999 北医) 考点:酶的分子结构及功能,抑制剂对酶促反应速度的影响 解析:(1)酶分单纯酶、结合酶,后者由蛋白质和非蛋白质部分组成,其中的蛋白质部分即 为酶蛋白。非蛋白质部分中与酶蛋白结合疏松,可用透析等方法除去的称辅酶,酶分子中必 需基团空间结构上相互靠近,组成具有特定空间结构的区域,这一区域称酶活性中心。 酶蛋白决定反应特异性,辅酶决定反应种类与性质,活性中心包括催化基团和结合基团,能 与底物结合,并催化底物发生化学反应将其转变为产物。 (2)与底物结构相似,可与底物竞争酶的活性中心,从而阻碍酶与底物结合的即为竞争性抑 制剂它能使反应Vmax不变Km值变大,故这种抑制作用可通过增加底物浓度来消除,非 竞争性抑制剂使反应 Vmax 降低,Km 不变,其与酶活性中心外的必需基团结合,不影响 酶与底物的结合,故 Km 值不变,因抑制剂与底物之间无竞争关系,故此抑制作用不能通 过增加底物浓度来消除。 十三、测定酶活性时,对底物浓度有何要求,为什么(1991北医) 考点:酶活性测定的条件 解析:测定酶活性时,首先底物的量要足够,以使酶被充分饱和,获取最高反应速度,充分 反映待测酶的活力,但底物量也不能过多,以 20~100Km 为宜,过高的底物浓度有时反 会对酶有抑制作用,这是因为同一酶分子上同时结合几个作用物分子,使酶分子的诸多必需 基团不能针对一个作用物分子进行催化攻击。 十四、简要说明,设计一个定量测定胰液中脂肪酶活性的方法需要考虑哪些因素(1995 北 医) 考点:酶活性的测定 热点:因为在生物组织中,酶蛋白含量甚微,所以我们要确定酶量的多寡主要是测定酶活性, 即在规定的实验条件下,测定该酶催化反应的速度,用单位时间内底物的消耗或产物的生成 量表示,因而测定过程中,要保持一定的实验条件,这就是酶活性测定中最重要的内容。 解析:许多因素可影响酶促反应速度,故要测胰液中脂肪酶活性需要考虑如下因素,使各种 因素相对恒定: ①酶的样品应作适

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