ctab法原理-第1部分
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从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中（》0。7mol/L NaCl），CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris…HCl （pH8。0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；
EDTA螯合Mg2＋或Mn2＋离子，抑制DNase活性；
NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；
β…巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时；由于蛋白与DNA 联结键已断；蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
使用酚的优点：1。有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1。能溶解10…15％的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2。不能完全抑制RNase的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚…氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚…氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na＋中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
DNA ladder的形成是连接核小体间的DNA被随机切割，形成质量不同的部分，由于切割是随机的，各部分的质量形成梯度，经过电泳，从而使分子量不同的部分形成梯度……
DNAladder的形成与细胞调亡密不可分 同时也是判断细胞调亡的重要标准
DNA提取及电泳检测
提取液：
1。CTAB提取缓冲液：2％CTAB、1。4mmol/L NaCl、20mmol/L EDTA（pH 8。0）、
2％PVP、0。4％β…巯基乙醇、100mmol/L Tris…HCl（pH 8。0）
2。NaAc：3mol/L，pH5。2
3。NaCl：5mol/L
4。TE：1mmol/L EDTA（pH 8。0）、10mmol/L Tris…HCl（pH 8。0）
5。TBE电泳缓冲液：90mmol/L H3BO4，2mmol/L EDTA，90mmol/L Tris…HCl，pH 8。5
（以上溶液均高温灭菌后保存。）
提取步骤：
1。取材0。3…0。5g，液氮研磨成粉末，加入800μl预热的CTAB缓冲液；
2。混匀后置于65℃水浴中40…50分钟，每隔10分钟上下颠倒混匀；
3。12000 rpm离心10分钟；
4。取上清，加入等体积的PCI（苯酚：氯仿：异戊醇=25：24：1），混匀后于摇
床上摇匀10分钟，10000 rpm离心10分钟；水分和盐胁迫下平邑甜茶根系细胞程序性死亡研究
5。取上清，再加入等体积的CI（氯仿：异戊醇=24：1），10000 rpm离心10分钟；
6。上一步骤重复一次；
7。取上清，加入2倍体积的冷冻无水乙醇，1/10体积的NaAC沉淀DNA；
8。…20℃静置30分钟。12000 rpm离心15分钟，弃上清，沉淀用70％乙醇洗3次，
室温下风干至无乙醇味（约30分钟），加入400μlTE溶解；
9。加入1μl RNase（10mg/L），37℃水浴1小时；
10。等体积CI抽提一次，取上清，加2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAC和等
体积的NaCl，…20℃放置1小时；
11。10000 rpm离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗3次，室温干燥，溶于TE中，放
置在…20℃冰箱内备用；
12。用20ml0。5×TBE配制2％（w/v）的琼脂糖凝胶（EB浓度约为0。5μg/ml），60v
恒压，电泳3小时，紫外分析仪上观察结果。
CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括Eli的某些株）中制备纯化DNA
去垢剂（表面活性剂）是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质，一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。
A．中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如山梨醇、司盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic（用作消泡剂、润湿剂、增溶剂）、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH…50柱除去；也可直接上DEAE…Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。
B．阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。前者可促进核蛋白的溶解，将核酸释放出来，并对核酸酶有一定抑制作用，常用于核酸的提取。
C．阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净（TMPB）、杜灭芬等，消毒灭菌类居多。
D．天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸类、多糖类（如环糊精）等。
E．两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质，起泡性好，去污力也强；在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征，其杀菌性很强。
蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键，如氢键、盐键和疏水力，引起天然构象的解体；它们并不破坏共价键，如肽键和二硫键，故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两类，SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂，而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉淀变性剂。一般而言，变性剂应用时常大大过量，破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克分子数，如1克蛋白质可可结合1。4g。 SDS溶于水可达25％，对温度敏感，W/V贮存液最为方便。需要注意的是SDS的钾盐是不溶性的，所以SDS溶液中要避免混入钾盐。 尿素极易溶于水，可达10mol/L；在8mol/L以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度活性的氰酸离子，故要防止高温。 三氯乙酸与过氯酸（TCA，PCA）都是极好的沉淀剂，能沉淀蛋白质和核酸，前者应用更为广泛。
